基于网络药理学及体外实验研究金莲花黄酮抑制肺纤维化的机制

　　肺纤维化是一种常见的临床常见的慢性、进行性、不可逆性间质性肺疾病，病理上表现为大量间质细胞增生及细胞外基质沉积 [1] 。确诊后，肺纤维化患者的 5 年平均生存率仅为 20% ～ 30% ，甚至低于某些癌症的生存率 [2] 。我国肺纤维化患者约 60 万人，全球约为 300 万人，而且其发病率尚未得到有效控制，目前对大多数间质性肺疾病的治疗手段极为有限，可用药物稀少。全球范围内，治疗肺纤维化的主导药物为吡菲尼酮和尼达尼布，经过临床验证，二者可以有效抑制特发性肺纤维化，但潜在胃肠道反应、肝损伤、出血及不耐受等不良反应，而且在多种纤维化肺疾病中并不能延长患者寿命。据临床评估，这些药物可以有效抑制特发性肺纤维化，但它们有胃肠道反应、肝损伤和出血等潜在的不良反应 [3] 。与此同时，受新型冠状病毒的影响，肺纤维化潜在危害加剧。《新冠肺炎确诊 1 年后的后遗症评估》中指出，在治愈后的患者中，最常见的肺部后遗症是肺部结节、肺部阴影、肺部纤维化以及支气管的扩张 [4] 。考虑到肺纤维化是影响公众健康的严重问题，因此非常需要开发安全、有效的可用于治疗肺纤维化疾病的药物。

　　金莲花为毛茛科金莲花属植物金莲花 Trollius chinensis Bge. 的干燥花，始见于《本草纲目拾遗》，具有抗氧化、抗菌、抗病毒、抗炎、抗肿瘤等多种药理作用 [5-6] 。对于肺纤维化的作用机制研究中证实氧化应激起到关键作用，而黄酮类成分具有较好的抗氧化活性。课题组前期研究证实金莲花黄酮可以有效抑制 PM2.5 诱导的大鼠肺纤维化 [7] ，但其具体作用机制并不清楚。网络药理学的整体性、系统性的特点与中药整体观、辨证论治的特点相符，为中药的药理研究提供了新的思路，为中西医临床前研究之间的结合创造了一种可行途径 [8] 。本研究通过网络药理学方法，研究金莲花黄酮抑制肺纤维化的作用机制，利用体外细胞实验对筛选出的潜在作用靶点进行验证，旨在揭示金莲花黄酮抑制肺纤维化的作用机制。

　　金莲花采摘于宁夏银川地区，由宁夏农林科学院提供，经宁夏农林科学院郭生虎教授鉴定为毛茛科植物金莲花 T . chinensis Bge. 的干燥花。

　　2.1.1 药物成分及靶点筛选 通过 TCMSP 数据库（ ） [9] ，以“金莲花”为关键词，以“口服生物利用度（ oral bioavailability ， OB ）≥ 30% ”“类药性（ drug-likeness ， DL ）≥ 0.18 ”为筛选条件，获得活性成分和靶点信息，筛选其中黄酮的成分 [10] 。 利用 Uniprot 数据库（ ）进行蛋白名称和基因名称的转换 [11] 。

　　2.1.2 金莲花黄酮“活性成分 - 靶点”网络的构建 将筛选后的金莲花成分进行筛选，提取黄酮成分，分别将 2 个金莲花黄酮成分标记为玄参黄酮和五羟黄酮，分别将 2 个黄酮各自对应的靶点进行汇总。随后，使用 Cytoscape 3.9.1 软件构建金莲花黄酮“活性成分 - 靶点”网络，进行可视化 [12] 。

　　2.1.3 肺纤维化疾病靶点获取 借助 GeneCards 和 Drugbank 数据库，以“ pulmonary fibrosis ”为关键词， 筛选相关基因 [13] 。将各数据库筛选后的基因对应的靶点进行汇总、整体后与药物靶点合并，筛选重复靶点。

　　2.1.4 蛋白质 - 蛋白质相互作用（protein-protein interaction ，PPI ） 网络的构建及分析 运用 Venny 插件，获取金莲花黄酮的药物靶点和肺纤维化靶点的 PPI 信息，并获取其共有靶点。将共有靶点导入 Cytoscape 3.9.1 软件进行可视化分析，并对共有靶点进行相关性分析，得到核心靶点 [13] 。

　　取干燥金莲花粉碎，过筛，称取 100 g ，加入 10 倍量的 70% 乙醇溶液，加热回流提取 2 h ，滤过后取滤液，减压浓缩，得粗黄酮。按 1 ∶ 4 的料液比加入 95% 乙醇沉淀，取滤液浓缩，冷冻干燥，得金莲花黄酮提取物 [14] 。以芦丁为对照品，分光光度法测定金莲花提取液中的总黄酮含量 [15] ，计算提取率。

　　2.3.1 超氧阴离子自由基清除能力测定 采用邻苯三酚比色法测定金莲花黄酮的超氧阴离子自由基清除能力。向各试管中加入 0.1 mol/L 的 Tris-HCl 缓冲液 4.5 mL ，后分别加入质量浓度为 10 、 20 、 50 、 100 、 250 、 500 、 1000 μg/mL 的金莲花黄酮溶液各 1 mL ，加入蒸馏水 2.4 mL ，摇匀后室温静置 3 min 后加入 10 mmol/L 的邻苯三酚溶液 0.1 mL 终止反应，蒸馏水调零，在 325 nm 下测定其吸光度（ A ）值 [16] ，计算超氧阴离子自由基清除率。

　　A 0 为水代替黄酮时测得的 A 值， A i 为不同质量浓度待测样品测得的 A 值， A j 为水代替邻苯三酚时不同质量浓度待测样品测得的本底 A 值

　　2.4.3 实验分组 A549 细胞以 1 × 106 个 / 孔接种于 6 孔板，培养 24 h ，设置对照组（含有细胞培养液）、模型组（含有 10 ng/mL TGF-β 的细胞培养液）和不同质量浓度（ 200 、 400 、 600 μg/mL ）金莲花黄酮组（含 10 ng/mL TGF-β 和不同质量浓度药物的细胞培养液）。

　　2.4.4 上皮间充质转化标志物表达 收集细胞，加入 RIPA 裂解液提取蛋白，冰上裂解 30 min 后， 4 ℃、 12 000 × g 离心 10 min ，取上清。使用 BCA 蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度后，加入上样缓冲液， 100 ℃煮沸 10 min 使蛋白变性。蛋白样品经十二烷基硫酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至 PVDF 膜，加入 5% 脱脂牛奶，室温封闭 2 h 后，分别加入 E-cadherin 、 collagen-1 、 α-SMA 、 Vimentin 和 β-actin 抗体， 4 ℃孵育过夜；洗涤后加入二抗，室温孵育 1 h ，加入 ECL 发光液显影，用 Image J 软件分析条带灰度值 [19-20] 。

　　2.4.7 统计学分析 数据使用Graphpad Prism 8.0 软件处理，采用单因素方差分析进行组间统计。

　　运用 Metascape 进行BP 、MF 、CC 富集分析，发现潜在作用靶点主要BP 集中在无机物应激反应、氧化应激、活性氧等，MF 主要集中在细胞因子及其受体（图2-A ）。KEGG 富集分析发现主要集中在癌症、脂质和动脉粥样硬化（图2-B ）。

　　金莲花通过 60% 乙醇提取后，混有一定量多糖， 后经乙醇沉淀，除去多糖，纯化后冻干， 3 批次金莲花黄酮提取率分别为 68.44% 、 71.24% 、 71.33% 。体外抗氧化活性测试结果（图 3 ）显示，随着金莲花黄酮质量浓度的升高，其抗氧化能力逐渐增强。当质量浓度超过 500 μg/mL 时，其超氧阴离子自由基清除率达到 60% 以上，羟基自由基清除率超过 80% ，而 DPPH 自由基清除率超过 90% ，表现出良好的抗氧化活性。

　　将金莲花黄酮作用于 A549 细胞，通过 CCK-8 法测试其活力，如图 4 所示， 100 ～ 800 μg/mL 金莲花黄酮对 A549 细胞活性无明显影响，说明在此质量浓度范围内并未表现出毒性作用。 A549 细胞经过 TGF-β1 诱导后，给予不同质量浓度金莲花黄酮进行干预，发现 200 ～ 800 μg/mL 金莲花黄酮显著抑制 A549 细胞活性（ P ＜ 0.05 、 0.01 、 0.001 ），而 600 、 800 μg/mL 作用强度相近，选择 200 、 400 、 600 μg/mL 作为金莲花黄酮后续实验剂量。

　　如图6-A 所示，与对照组比较，模型组细胞中SOD 活性明显降低（P ＜0.05 ），MDA 水平明显升高（P ＜0.01 ）；与模型组比较，金莲花黄酮各剂量组SOD 活性明显升高（P ＜0.05 、0.01 、0.001 ），600 μg/mL 金莲花黄酮组MDA 水平明显降低（P ＜0.05 ），表明金莲花黄酮可以明显改善TGF-β1 诱导的氧化应激。ROS 检测结果（图6-B ）也证实了这一结果，模型组ROS 信号强度明显增强（P ＜0.001 ），各给药组ROS 信号强度组明显减弱（P ＜0.001 ）。Western blotting 检测氧化应激相关蛋白表达，如图6-C 所示，与对照组比较，模型组Keap1 蛋白表达水平显著降低（P ＜0.001 ），Nrf2 蛋白表达 水平升高，受Nrf2 调控的HO-1 和NQO-1 蛋白表达水平均显著升高（P ＜0.001 ）；与模型组比较，400 、 600 μg/mL 金莲花黄酮组 Keap1 蛋白表达水平进一步显著降低（ P ＜ 0.01 、 0.001 ）， 200 、 600 μg/mL 金莲花黄酮组 Nrf2 蛋白表达水平均进一步显著升高（ P ＜ 0.01 、 0.001 ），各给药组 HO-1 和 NQO-1 蛋白表达水平均进一步显著升高（ P ＜ 0.01 、 0.001 ）。

　　结合网络药理学靶点预测，随后对 Akt 及p-Akt 进行检测（图7 ）发现，与对照组比较，模型组p-Akt 蛋白表达水平显著升高（P ＜0.001 ），说明Akt 被激活，金莲花黄酮则可以抑制其激活（P ＜0.001 ）。随后在对纤维化经典信号通路进行检测时发现，模型组p-Smad2/3 、mTOR 及NF-κB 同样被激活（P ＜0.001 ），金莲花黄酮可以抑制p-Smad2/3 、mTOR 及NF-κB 激活（P ＜0.001 ）。

　　在正常情况下， Nrf2 位于胞质中，与其特异性抑制性受体Keap1 结合，无活性且Keap1 可促进Nrf2 的泛素化降解过程，因此Nrf2 表达较低[22] 。但在氧化应激作用下，Nrf2 与Keap1 发生解偶联，转移入核，通过与小分子肌腱纤维瘤蛋白异二聚体化，从而启动，调控NQO1 、HO-1 等抗氧化酶基因的表达[23] 。Nrf2/Keap1 信号通路对肺纤维化的影响越来越受到关注，研究表明，Nrf2/Keap1 信号通路上调HO-1 、NQO1 等抗氧化物的表达，调控体内氧化应激水平，降低肺纤维化作用进程，减少胶原的合成，保护肺部组织，提高细胞抗性，抑制成纤维细胞转分化为肌成纤维细胞[24-25] 。

　　此外， 磷脂酰肌醇3- 激酶（phosphatidylinositol 3-kinase ，PI3K ） /Akt 信号通路被证实直接参与II 型肺泡上皮细胞的上皮间充质转化发生，促进肺纤维化发展[26] 。PI3K/Akt 信号通路能使受体酪氨酸激酶活化，从而使细胞质上的PI3K 易位至细胞膜，通过调控下游mTOR 及ROS 等参与肺纤维化[27-28] 。此外，PI3K/Akt 信号通路激活与NF-κB 信号通路密切相关[29] 。NF-κB 在肺纤维化早期的高表达与PI3K/Akt 信号通路激活相关，Akt 能通过磷酸化激活NF-κB 抑制因子（inhibitor of NF-κB ，IκB ）激酶，导致IκB 与NF-κB 分离，激活NF-κB 信号通路，诱导目的基因表达，产生炎症反应，加重肺纤维化的进程[30] 。

　　本研究首先借助网络药理学，分析金莲花黄酮与肺纤维化的潜在靶点，通过分析筛选出金莲花黄酮作用肺纤维化的作用靶点，与此同时， KEGG 分析显示金莲花黄酮作用肺纤维化最有可能的潜在作用机制为氧化应激，潜在作用靶点为AKT1 、TNF 、TP53 、VEGFA 、IL-6 、IL-1B 。随后，本研究结合体外细胞模型进行验证。实验结果显示，金莲花黄酮在体外具有良好的抗氧化作用，作用细胞有效质量浓度为200 、400 、600 μg/mL ，而且显示出质量浓度相关性，且不存在细胞毒性。金莲花黄酮可以有效抑制TGF-β1 诱导后上皮间充质转化标志物的表达。氧化应激检测也证实了金莲花黄酮具有良好的抗氧化作用，金莲花黄酮能够增强SOD 活性，降低MDA 水平，流式细胞仪检测ROS 表达结果发现，当细胞出现上皮间充质转化时，ROS 表达明显增强，而金莲花黄酮可以有效降低ROS 表达，说明金莲花黄酮可以降低细胞内氧化应激水平。

　　在对氧化应激经典通路 Keap1/Nrf-2 信号通路检测时发现，当细胞出现上皮间充质转化时，二者进行解离，Keap1 表达逐渐降低，Nrf2 逐渐增强，受Nrf2 调控的HO-1 与NQO-1 表达也出现差异性变化，说明金莲花黄酮可以作用Keap1/Nrf2 信号通路，发挥抗氧化作用，进而抑制上皮间充质转化，这与网络药理学预测潜在作用机制相对应。随后，在对潜在作用靶点进行检测时发现Akt-1 表现出明显的差异性。而PI3K/Akt/mTOR 信号通路与肺纤维化的发生与发展息息相关，随后对mTOR 的检测结果也证实了推测。

　　本研究结果证明金莲花黄酮具有良好的抗氧化活性，并且对于 TGF-β1 诱导的A549 细胞上皮间充质转化具有明显的抑制作用，其作用机制及作用靶点通过网络药理学进行验证，检测结果也验证了网络药理学的分析结果。基于这一发现，在后期的实验设计中将重点探索金莲花黄酮在动物体内抑制肺纤维化的药效作用以及其潜在作用机制。本研究不仅为网络药理学在中药防治肺纤维化研究中的必要性提供有力的证据，也为金莲花黄酮开发提供了基础数据，与现代实验手段相结合，丰富了中药在临床上的应用可能性。

　　来 源：王家才，段星星，张 波，辛 杰，陈虞超，郭生虎，李新朋，王 振．基于网络药理学及体外实验研究金莲花黄酮抑制肺纤维化的机制 [J]. 中草药, 2023, 54(7):2144-2154.

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