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时间:2021-01-18 05:16 点击次数:119

  

 

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  Chapter 4 萃 取 Solvent Extraction ? 萃取是生物阔别中常用的单元掌握 质地 前统治 生物反映 工程 生物永诀 工程 产品 固 液 分 离 分 离 提 取 纯 化 精 制 何谓萃取 ? 诈欺在两个互不相溶的液相中各类组分( 包罗宗旨产物)溶解度的分化,从而抵达 别离的对象 一律相溶的意想,取舍与方向物结构左近 的溶剂 ? 分子布局一样:组成,官能团 ? 根据萃取标的物的介电常数寻得极性相 近的溶剂为萃取溶剂. 一个良好的溶剂要知足以下几方面恳求: ? 有大的萃取容量:即单位体积的萃取溶剂 能萃取大宗的产物 ? 有优良取舍性:理思处境只萃取产物而不 萃取杂质 ? 与被萃取的液相(平居是水相)互溶度小, 且粘度低,;界面张力不或适中,有利于相 的分辩和两相分袂. ? 溶剂的接管和再便利 ? 化学坚实性好,不易了解,对兴办腐蚀性小 ? 经济性好,价廉易得 ? 安宁性好,无毒性或毒性低. ? 差异的萃取剂对溶质的萃取功效差异。 如疏水性的青霉素G和V酸性很强,其 pKa值为2.5~3.1,相对分子质地诀别为 334和350,适当用有机溶剂从发酵液中 萃取,在pH 2.5~3.0局部内,用乙酸戊 酯和乙酸丁酯行为萃取剂的萃取效能高 (如下表)。 青霉素在区别萃取剂中的分拨系数 溶剂 乙酸戊酯 乙酸丁酯 pH 2.5(溶剂/水) pH 7.0(溶剂/水) 45/1 47/1 1/235 1/186 乙酸乙酯 氯仿 39/1 39/1 12/1 1/260 1/220 1/190 物理萃取和化学萃取 ? ? 物理萃取即溶质按照相通相溶的意想在两 相间达到分派平均,萃取剂与溶质之间不 产生化学反响。比喻,诈欺乙酸丁酯萃取 发酵液中的青霉素即属于物理萃取。 化学萃取则诈欺脂溶性萃取剂与溶质之间 的化学相应天才脂溶性复关分子实现溶质 向有机相的分配。萃取剂与溶质之间的化 学呼应包罗离子交换和络合响应等。 化学萃取中平日用煤油、己烷、四氯化碳和苯等有机 溶剂熔解萃取剂,改革萃取相的物理件质,此时的有 机溶剂称为稀释剂(diluent)。 ? 由于氨基酸和少少极性较大的抗生素的水溶 性很强,在有机相中的分配系数很小甚至为 零,哄骗一般的物理萃取功用很低,需接纳 化学萃取。 ? 可用于抗生素的化学萃取剂有长链脂肪酸 (如月桂酸)、烃基磺酸、三氯乙酸、四丁胺 和正十二烷胺等。它们与抗生素酿成复闭物 分子的疏水性比抗生素分子本身高得多,从 而在有机相中有很高的溶解度。 萃取和反萃取 ? 在溶剂萃取辞别历程中,当完毕萃取操 作后,为进一步纯化主意产物或便于下 一步离别把持的执行,屡屡必要将标的 产物改动到水相。这种治疗水相条款, 将对象产物从有机相转入水相的萃取操 作称为反萃取(Back extraction)。除溶剂 萃取外,其谁萃取经过凡是也要涉及反 萃取控制。 敷衍一个完备的萃取历程,通常在萃取和反 萃利用之间填充冲洗驾驭,如下图所示, 清洗摆布的标的是取消与主意产物同时萃 取到有机相的杂质,抬高反萃液中宗旨产 物的纯度。下图中虚线暗意洗濯段出口溶 液中含有少量对象产物,为降低收率,需 将此溶液返回到萃取段。始末萃取、冲洗 和反萃取把握,大一面目的产物加入到反 萃相(第二水相),而大个人杂质则残留在 萃取后的料液相(称作萃余相)。 萃取、洗涤和反萃把握源委示计划 萃取体系的构成 – 料液:供提取的溶液,平素水溶液 – 溶质:从料液中提取出来的物质 – 萃取剂:用来萃取产物的溶剂 – 萃取液:溶质改革到萃取剂中变成的溶液 – 萃余液:被萃取出溶质后的料液称为~. Light phase 萃取相 杂质 萃取剂 溶质 料液(原) Heavy phase、萃余相 分配系数 在必然温度和压力下,溶质分拨在两个不相 溶的溶剂中来到平衡后,溶质在这两相的 浓度比为一常数K,此常数称为分派系数 是权衡萃取体例是否关理的首要参数: k ? y/x y-----平衡时溶质在萃取相中的浓度 X-----平均时溶质在萃余相中的浓度 ?应用进程中,分配系数K越大,提 取效劳也越大,萃取就越便当实行 一切。当K值较小时,可以采纳分 次加入溶剂、不绝对此提取来降低 萃取率。 ? 产物的萃取效用与萃取溶剂和水相的性 质有关. 水相条款对萃取的教化 ? ? 1)PH 作用选择性.如青霉素在PH2萃取,萃取 液中(醋酸_酯)青霉烯酸可达青霉素_衡量 2.5%,在PH3中则低落到4%,PH选择在使产物 坚韧的控制内. 2)温度:劝化平稳性,平时在低温下进行,感导 分派子数 ?3)盐析:低落产物在水中的熔化度. 如提Vb12时加硫铵,促进Vb12从水 转入有机相中;提青霉素进加NaCl. 增长青霉素从水转入有机相中 产物易溶于有机溶剂中.复合物在必然条 件下又要易理会.如青霉素可用脂肪碱作 带溶剂.(化学萃取) ? 4)带溶剂:它们能与产物造成复关物,使 萃取运用 ? (1)同化:料液与萃取剂充分羼杂变成具有 很大比皮相积的乳浊液.产物自料液转入 萃取剂中. ? (2)死别:别离或萃取相和萃余相 ? (3)溶剂领受:从萃取相均分离出有机溶剂 . ?所需建筑:羼杂器(如搅拌搀和器 )、辞别器(如碟片式离心念)、 溶剂汲取装配(如蒸馏塔) ?混合萃取和阔别也可在团结台征战 中,如Alfa-Laval萃取机。 萃取进程 ? ? 单级萃取: 料液与萃取剂加入夹杂物中搅拌均衡后的 溶液送到分袂器内离别得萃取相L萃余相 R,L送到采纳器. 多级萃取:是家产分娩最常用的萃取历程 别离出力高 产品汲取率高 溶剂用量少 单级萃取 ? 使含溶质的溶液(h) 和萃取剂(L)混 合,静止后分成两层。 多级错流萃取:将多个混杂-澄清器单元串联 起来,各个搀杂器中分别通入希奇萃取剂, 而料液从第甲等通入,逐次进入下一级复杂 器的萃取驾御称为多级错流交兵萃取, 每次加新溶剂, 方针物浓度低, 萃取全体 多级逆流萃取将多个混合-清澈器单元串联起 来,永诀在左右两端的搀杂器中不休通入料液 和萃取液,使料液和萃取液逆流交战,即构成 多级逆流打仗萃取。 反向加入,宗旨物在萃取液中浓度高,耗量少 ? 三级错流萃取装置a—艾德连式 ? 三级错流萃取安装b—泵夹杂死别器 ? 三级错流萃取装置c—加挡-齐格勒干戈 器 ? 三级错流萃取安装d—霍米-莫脱干戈器 乳化和去乳化 ? 本质发酵产物的萃取把持中常发作乳化现 象。乳化即水或有机溶剂以微小液滴景象 分袂于有机相或水相中的形象。 ? 生长乳化后使有机相和水相分层坚苦,出 现两种夹带:①发酵废液(萃余液)中夹带 有机溶剂(萃取液)微滴,使对象产物受到 吃亏;②有机溶剂(萃取相)中夹带发酵液 (萃余液),给后操持掌管带来闲难。 油水是互不相容的,要变成稳固的乳浊液 ,日常要有第三种物质-外表活性剂的存 在。 ? 皮相活性剂指一端具亲水基团,一端具有亲 油基团,发酵液中PR(O/W)是要紧的表 面活性剂. ? 假若当表面活性剂的亲水基团强度大于亲 油基团易天资水包油型,反之变成油包水型 . ? ? 滋长乳化的紧要理由是发酵液中生涯的 蛋白质相固体颗粒等物质,这些物质具 有外貌活性剂的感导,使有机溶剂(油) 和水的外面张力消浸,油或水易于以微 小液滴的景象分散于水相或油相中。 ? 孕育乳化后,需接纳某种举措捣乱乳浊 液,提升萃取掌握收率。 破乳法子 ? 在施行萃取独霸前,对发酵液进行过滤 或絮凝沉淀照料,可打消大个人蛋白质 及固体微搅,提防乳化形象的爆发。 ? 破乳举措:过滤,离心,进入电解质,物理法( 加热,稀释释,吸附)、顶替法(戊醇)、转型 法 ? 防御乳化:除去Pr. 双水相萃取 Two-aqueous phase extraction 基因工程产品如蛋白质和酶时常是胞内 产品,需经细胞破碎后本领提取、纯化, 细胞颗粒尺寸的革新给固-液分离带来了困 难,同时这类产品的活性和效用对pH值、 温度和离子强度等曰镪身分奇异敏感。 由于它们在有机溶剂中的熔解度低而且会变 性,所以传统的溶剂萃取法并不相宜。 选用在有机相中扩张表面活性剂出现反胶束 的要领可克服这些问题,但同样生活相的 别离标题。 ?于是基因工程产品的营业化急迫需 要启迪相宜大范畴生产的、经济简 便的、速疾高效的诀别纯化时期。 此中双水相萃取时期(two-aqueous phase extraction,ATPS),又称水溶液 两相分配技巧(Partion of two aqueous phase extraction)是连年来产生的引 人瞩目、极有前道的新型诀别技巧 。 双水相萃取法的特性是可以保留产物的活性,周密操 作能够不息化,在撤消细胞或细胞碎转瞬,还可以纯化蛋 白质2~5倍,与古代的过滤法和离心法去除细胞碎片相比, 无论在收率上仍是资本上都要精良得多。 除此除外,经管量一样时,双水相萃取法比古代的永逝方 法,作战需用量要少3~10倍,以是已被宽广地操作在生物 化学、细胞生物学和生陨命工周围,举行生物蜕化、蛋白 质、核酸和病毒等产品的辞别纯化和体味等。用此法来提 纯的酶已达数十种,其永逝通过也来到特地范围,如乙醇 脱氢酶的永别已到达几十千克湿细胞范畴,β -半乳糖苷酶 的提取也到了中试规模等。 双水相萃取法和守旧的死别办法(如盐析或有机 溶剂重淀等)相比也有很大的优势,如以β-半乳 糖苷酶为例,用浸淀或双水相萃取纯化的比赛 见下表。 ? 双水相体制:某些亲水性高分子团圆物 的水溶液跨过确定浓度后可形成两相系 统。 ? 哄骗物质在不相溶的,两水相间分派系 数的差别进行萃取的设施 ? 专揽:蛋白质特别是胞内蛋白质的分离 纯化。 一、双水相编制 ? 酿成源由:团圆物的不相容性,即聚闭物分子的 空间窒歇感导,无法造成均一相,具有相分离倾 向,决定条件下分成两相。 ? 常用于分袂的双水相体制: –双团聚物:聚乙二醇(PEG)/葡聚糖(Dex)。该 形式上相富含PEG,下相富含Dex; –团圆物与无机盐:聚乙二醇(PEG)/磷酸钾( KPi)。该体系上相富含PEG,下相富含KPi。 双水相萃取的理由 ?根据悬浮粒子与其界限物质具有的 杂乱的相互感化: – 氢键 – 电荷力 – 疏水陶染 – 范德华力 – 构象效应 a 两相区 两相区 均相区 双节线 临界点 ? 双水相式样的相图(双节线) – 系线:延续双节线上两点的直线。 ?同一系线上各点:两相组成一样,体积不合 。 ?系线(TMB)长度:衡量两相间相对分袂的尺 度。越长则两相间本质差别越大,反之则越 小;趋向于零时,(双节线上的点,临界点 ),两相差别没落,成为均一相。 在系线上各点处形式的总浓度不合,但 中分成组成一样而体积分化的两相。两相的 体积好似苦守杠杆规矩,即 二、双水相中的分拨平均 与溶剂萃取一律,溶质在双水相中的分 配系数也用m=c2/c1暗指。为简略起见,用c1 和c2永诀暗指均衡状态下下相和上相中溶质的 总浓度。 有合双水相格式中溶质分配平均的理 论已有很多议论报导。然而,由于影 响双水相系统中溶质分拨均衡的成分 终点繁杂,很难作战圆满的热力学理 论体制。从双水相萃取通过企图的角 度出发,笃信习染分配系数的首要因 素好坏常主要的。已有的大宗斟酌表 明,生物分子的分配系数取决于溶质 与双水相编制间的各类互相重染,其 中重要有静电浸染、疏水感染和生物 lnm=lnme+lnmh+lnml 亲和熏陶等。因此,分配系数是各式 彼此教化的和. me,mh,ml 分别为静电熏陶、疏水熏陶和 生物亲和劝化对溶质分配系数的功勋。 感化物质分配平衡的位置 ? 成相高聚物浓度--界面张力 ? 成相高聚物的相对分子量 –平日来说,蛋白质等高分子量物质易荟萃于 低分子量相 ? 盐类(包罗离子的样板和浓度、离子强度、pH值 ), ? 溶质的物理化学脾气(席卷分子量、等电点)以 及方式的温度等。 三、沾染萃取成绩的成分 ?1.成相团圆物 – 分子量:低重团聚物的分子量,则蛋 白质容易分派于富含该团聚物的相中 。 – 总浓度:越大则两相本质的诀别越大 ,系线越长,蛋白质越容易分派于其 中的某一相。 2.盐和睦冲液的熏陶 ? 盐的种类和浓度对分配系数的习染首要呼应在 对相间电位和蛋白质疏水性的感动。在双团圆 物格局中,无机离子具有各自的分配系数,不 同电解质的正负离子的分派系数个同,当双水 相系统中含有这些电解质时,由于两相均应各 自纠合电中性,从而滋长分歧的相间电位,因 此,盐的种类(离子组成)感染蛋白质、核酸等 生物大分子的分配系数,盐浓度不但作用蛋白 质的外貌疏水性,况且搅扰双水相编制,转折 各相中成相物质的组成和相体积比。 譬喻,PEG/KPi体制中上、下相(或称轻重相 )的PEG和磷酸钾浓度以及Cl离子在上、下 相中的分拨平衡随增添NaCl浓度的增大而 调换。这种相组成即相性情的调换直接影 响蛋白质的分拨系数。离子强度对分裂蛋 白质的感导程度不合,诳骗这一特征,通 过调度双水相系统中的盐浓度,可有效地 萃取死别分歧的蛋白质。 ?3.pH值 – 习染蛋白质的外面电荷数Z:感化 蛋白质的解离度。 – 感化??:感动磷酸盐的解离。 ?4.温度 – 要紧感导双水相格式的相图。 – 大规模双水相萃取左右一样在室温下实行 ,主要基于以下牵挂: ? PEG对蛋白质有结实习染; ? 溶液粘度较低,方便相分袂; ? 俭朴冷却费用。 双水相萃取的利益 较多用于胞内酶的提取和精制 ?平衡期间短、含水量高、截面张力 小,特殊适宜于生物活性物质的分 离纯化 ?安排简易 ?易于推广 要顺手独霸双水相萃取应满意的条件 : ?欲提取的酶和细胞碎片应分派在不 同的相中; ?酶的分拨系数应充裕大,使在确定 的相体积比时,经验一次萃取,就 能得回较高的收率; ?两相用离心术很便利永逝。 四、双水相萃取掌握 ?1.萃取和平衡 ?1)双水相编制的取舍 : – 服从目的蛋白质和杂质的疏水性、分子量 、等电点和表面电荷等特性上的辩白,综 合利用静电陶染、疏水感染和推广合意种 类和浓度的盐,可弃取性萃取倾向产物。 – 盘算试差实行,确定最佳萃取式样:常利 用多组10mL刻度离心管实行分配平衡实 验。 ? 配制高浓度的聚闭物和盐的备用溶液, 诈欺其配制一系列差别浓度、pH和离子 强度的双水相; ? 投入料液后,再加水稀释,然后充分混 关; ? 离心使两相扫数诀别; ? 永别测定上、下相中宗旨产物浓度或生 物活性,企图分拨系数。 ?2)胞内蛋白质的萃取 –优势:可选择性地使细胞碎片分 配于下相,目标产物分拨于上相 ,同时告终主意产物的部门纯化 和细胞碎片的退却。 – 细胞匀浆液浓度取舍: ?为降低成本,应尽量高,但过高会 干扰方式,低落分配系数,方式粘 度增高,相永别艰苦。 ?大凡上限为200-400g湿细胞/Kg萃 取体例。 2.坎坷相的永别 诳骗重力和离心力 离心沉降可大大加快相阔别速度, 并易于无间化垄断。对含细胞碎 片的萃取体例,少于40秒。 3.多聚物的永别 ?后退产物地点相中的多聚物取得纯 净物 ?产物若漫衍在PEG富集的相中,相 与相别离后,上相中加入盐,酿成 新的双水相编制,在关适条件下, 蛋白质被沉新萃取 参加盐相, PEG 获得收受,盐中少量剩余的PEG可 用超滤或透析法撤除。 五、运用 ?多步萃取 – 细胞匀浆液中标的产物可阅历多步萃取获 得较高的纯化倍数。 ? 大界限双水相萃取 – 由于相混合能耗低,相平均期间短,故双水相 萃取范畴增加至极便利,10mL刻度离心管的实 验究竟可准确扩充随地理200Kg细胞匀浆液规模 。

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