仪器百科之仪器类型简介：液相色谱仪

　　1903年俄国化学家 M. C. 茨维特首先将液相色谱法用于分离叶绿素。气相色谱不能由色谱图直接给出未知物的定性结果，而必须由已知标准作对照定性。当无纯物质对照时，定性鉴定就很困难，这时需借助质谱、红外和化学法等配合。另外大多数金属盐类和热稳定性差的物质还不能分析。此缺点可高效液相色谱法来克服。

　　液相色谱仪根据固定相是液体或是固体，又分为液-液色谱(LLC)及液-固色谱(LSC)。现代液相色谱仪由高压输液泵、进样系统、温度控制系统、色谱柱、检测器、信号记录系统等部分组成。与经典液相柱色谱装置比较，具有高效、快速、灵敏等特点。

　　现代液相色谱仪由储液器、泵、进样器、色谱柱、检测器、记录仪等几部分组成。

　　储液器中的流动相被高压泵打入系统，样品溶液经进样器进入流动相，被流动相载入色谱柱（固定相）内，由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数，在两相中作相对运动时，经过反复多次的吸附-解吸的分配过程，各组分在移动速度上产生较大的差别，被分离成单个组分依次从柱内流出，通过检测器时，样品浓度被转换成电信号传送到记录仪，数据以图谱形式打印出来高效液相色谱仪主要有进样系统、输液系统、分离系统、检测系统和数据处理系统，下面将分别叙述其各自的组成与特点。

　　一般采用隔膜注射进样器或高压进样间完成进样操作，进样量是恒定的。这对提高分析样品的重复性是有益的。

　　该系统包括高压泵、流动相贮存器和梯度仪三部分。高压泵的一般压强为l．47～4．4X10Pa，流速可调且稳定，当高压流动相通过层析柱时，可降低样品在柱中的扩散效应，可加快其在柱中的移动速度，这对提高分辨率、回收样品、保持样品的生物活性等都是有利的。流动相贮存器和梯度仪，可使流动相随固定相和样品的性质而改变，包括改变洗脱液的极性、离子强度、PH值，或改用竞争性抑制剂或变性剂等。这就可使各种物质（即使仅有一个基团的差别或是同分异构体）都能获得有效分离。

　　该系统包括色谱柱、连接管和恒温器等。色谱柱一般长度为10～50cm（需要两根连用时，可在二者之间加一连接管），内径为2～5mm，由优质不锈钢或厚壁玻璃管或钛合金等材料制成，柱内装有直径为5～10μm粒度的固定相（由基质和固定液构成）．固定相中的基质是由机械强度高的树脂或硅胶构成，它们都有惰性（如硅胶表面的硅酸基因基本已除去）、多孔性（孔径可达1000?）和比表面积大的特点，加之其表面经过机械涂渍（与气相色谱中固定相的制备一样），或者用化学法偶联各种基因（如磷酸基、季胺基、羟甲基、苯基、氨基或各种长度碳链的烷基等）或配体的有机化合物。因此，这类固定相对结构不同的物质有良好的选择性。例如，在多孔性硅胶表面偶联豌豆凝集素（PSA）后，就可以把成纤维细胞中的一种糖蛋白分离出来。

　　另外，固定相基质粒小，柱床极易达到均匀、致密状态，极易降低涡流扩散效应。基质粒度小，微孔浅，样品在微孔区内传质短。这些对缩小谱带宽度、提高分辨率是有益的。根据柱效理论分析，基质粒度小，塔板理论数N就越大。这也进一步证明基质粒度小，会提高分辨率的道理。

　　再者，高效液相色谱的恒温器可使温度从室温调到60C，通过改善传质速度，缩短分析时间，就可增加层析柱的效率。

　　高效液相色谱法只要求样品能制成溶液，不受样品挥发性的限制，流动相可选择的范围宽，固定相的种类繁多，因而可以分离热不稳定和非挥发性的、离解的和非离解的以及各种分子量范围的物质。与试样预处理技术相配合，HPLC所达到的高分辨率和高灵敏度，使分离和同时测定性质上十分相近的物质成为可能，能够分离复杂相体中的微量成分。随着固定相的发展，有可能在充分保持生化物质活性的条件下完成其分离HPLC成为解决生化分析问题最有前途的方法。

　　由于HPLC具有高分辨率、高灵敏度、速度快、色谱柱可反复利用，流出组分易收集等优点，因而被广泛应用到生物化学、食品分析、医药研究、环境分析、无机分析等各种领域。高效液相色谱仪与结构仪器的联用是一个重要的发展方向。液相色谱-质谱连用技术受到普遍重视，如分析氨基甲酸酯农药和多核芳烃等；液相色谱-红外光谱连用也发展很快如在环境污染分析测定水中的烃类，海水中的不挥发烃类，使环境污染分析得到新的发展。

　　首先是如何看指标。液相色谱仪的指标很多，有泵的、检测器的、色谱柱等等。我们认为要看主要技术指标，根据国家标准，仪器的主要指标有噪音，漂移，最小检测浓度，定性定量重复性等。这些指标都要放在系统，回路里去看，去比较。就是需要把各单元装置都要联接好，如接好色谱柱，进样阀，并且要通上流动相。因为您在分析中也都是联接好以后才可以进行分析的，而不是单单用个检测器或是泵的。然后在这个基础上，我们再去比较这些主要指标。

　　噪音是指由仪器的电器元件、温度波动、电压的线性脉冲以及其他非溶质作用产生的高频噪声和基线的无规则波动。噪音的大小直接关系到仪器的检测灵敏度，噪音越大，检测的灵敏度就越低。对于检测低含量的样品就要求仪器的噪音越小越好，否则噪音过大将会导致基线不稳，甚至影响分析结果。

　　最小检测浓度是反映仪器灵敏度的重要参数。CL=2×Nd×C/ H（CL ：最小检测浓度 Nd: 噪音 C：样品浓度最小检测浓度 H：样品峰高）由上式可见，最小检测浓度是和噪音成正比的，噪音越大，最小检测浓度就越大，灵敏度就越低。某些厂家回避了这个指标，说明他们不愿在最小检测浓度的基础上去比较噪音。

　　漂移是指仪器稳定后一段时间内基线漂离原点的距离，通常用来衡量仪器稳定快慢。高品质的仪器能在较短的时间内达到稳定，从而在一定程度上提高了分析效率。

　　定性定量重复性主要是考核仪器稳定性的指标，这对于分析样品来说是非常重要的。好的仪器其稳定性应该是十分优秀的，这就要求多次进样保留时间及含量的一致性，这样做出来的结果才能使人信服。

　　有的朋友会认为这些指标好像都是检测器的。对的，但是就前面所说条件是要放在整个回路和系统里去看去比较。例如：泵的脉动会直接影响噪音指标，泵的流量准确度、精确度指标，以及密封性不好也会影响相关指标。所以要系统地看指标。

　　操作方便性无论是对新手还是成熟的用户都是很重要的。操作越简单，有利于提高分析效率，也为以后分析方法的拓展提供有力的帮助。

　　这里指的是仪器的整体开发，是一个完整的系统。目前市场上有这个现象，说我的泵是进口的，或者是检测器怎么好，用了什么很多的进口件组装等等。其实这是个误区。液相色谱仪是个复杂的系统，不是整体开发的，各项指标之间、软件和硬件、硬件和硬件等都不匹配，整体水平不会高到哪里去，而且在售后服务方面对用户也是不负责任的。

　　整体开发的主要优点有：各项技术指标统一、仪器各单元的通信协调、能够建立一个整体的数字化评价系统、体现了企业的科技及开发实力。

　　国外知名的仪器生产厂家的产品也是整体开发的，所以能够保证仪器的整体水平。

　　液相色谱仪是利用混合物在液固或不互溶的两种液体之间分配比的差异，对混合物进行 先分离，而后分析鉴定的仪器。液相色谱仪在生物化学、生物医学、环境化学、石油化工等 领域均有广泛应用。那么，液相色谱仪在使用中有哪些常见故障? 又该如何处理呢?

　　措施：如果是缓冲液盐分沉积于柱内，则用 40～50℃的纯水低速正向冲洗柱子，逐渐提高 流速冲洗，柱压大幅度下降后再用常温纯水清洗，最后用纯甲醇冲洗柱子 30分钟。如果是样品污染沉积导致，则用纯水反向冲洗柱子，再用甲醇冲洗，随后用甲醇+异丙醇( 4+6) 冲洗柱子，再用甲醇冲洗，然后用纯水冲洗，最后用甲醇冲洗正向冲洗柱子 30分钟。

　　原因：主要是由于过滤器长期沉浸于乙酸铵等缓冲液内，内部霉菌繁殖形成菌团阻塞了过滤 器导致。

　　措施：将过滤器浸泡于 5%硝酸溶液中，利用超声清洗既分钟。或者将过滤器浸泡于 5%硝 酸溶液中12～36小时，再用纯水清洗，打开 pur ge键清洗脱气，直到没有气泡冒出。打开泄压阀，打开泵，纯水冲洗过滤器 1小时左右。

　　措施：更换密封垫圈，或用一个 50ml 的玻璃针筒在泵的出口处帮助抽出空气。

　　措施：观察流动相的量，动相要充分脱气。如果是单向阀和阀座不能密封，则拆下单向阀, 放入盛有丙酮的烧杯用超声波清洗。

　　措施：色谱柱被污染则需清洗色谱柱。如果柱头填料塌陷或硬结，则去除硬结部分，冲新装 入新填料。反复滴甲醇，压紧不锈钢杆，直至填满。柱头用甲醇冲洗干净。

　　措施：更换进样阀垫圈。如果是加样针不到位，则将加样针插到底，液量不足则注射样品溶 液后须快速、平稳地从 LOAD状态转换到 I NJECT状态。避免注射过浓的样品溶液。

　　液相色谱仪是一种精度极高的检测仪器，在环境、食品、生物、医药行业都有广泛的应用。实验淘为您简单介绍在液相色谱仪检测分析样品的几个要点。

　　我国药品标准中没有规定色谱柱的长度及填料的粒度，因此每次检测一个新样品时都须重新调整流动相，所以建议第一次检验样品时配备适量的流动相即可，以免浪费。制备流动相的标准，主峰一般应调至保留时间为6~15分钟为宜。弱电解质的流动相其重现性更不容易达到，应当注意充分平衡色谱柱。

　　样品溶液从待检测样品原料中提取出来之后，须经氮吹仪提纯结晶之后配置成一定浓度的溶液，再使用溶剂过滤器进行过滤处理，方可进入仪器。除此之外，盛放溶液的溶剂避免使用塑料材质，塑料容器常含有高沸点的增塑剂，可能释放到样品液中造成污染，而且还会吸留某些药物，引起分析误差。某些碱性药物会被玻璃容器表面吸附，影响样品中药物的定量回收，因此必要时应将玻璃容器进行硅烷化处理。

　　检测样品的进样量一般为 10L，主要根据定量环的规格而定，目前多数 HPLC系统采用定量环规格有10L、20L和 50L，因此应注意进样量是否一致。

　　样品进入色谱柱后，第一次测定时，应先将空白溶剂、对照品溶液及供试品溶液各进一针，并尽量收集较长时间的图谱（30分钟以上），以便确定样品中被分析组分峰的位置、分离度、理论板数及是否还有杂质峰在较长时间内才洗脱出来，确定是否会影响主峰的测定。

　　检测结果的计算主要根据色谱图，色谱图是色谱仪定性定量分析的依据。色谱图的横轴表示保留时间，可以作为色谱仪器实现定性分析的依据；色谱峰上的极大值是定性分析的依据，而色谱峰所包罗的面积则取决于对应组分的含量，定量分析的依据。需要注意的是，由于有些对照品标示含量的方式与样品标示量不同，有些是复合盐、有些含水量不同、有些是盐基不同或有些是采用有效部位标示，检验时须注意。

　　②柱在线ml / mi n的增量逐步进行，一般不超过 1ml / mi n，反之亦然。否则会使柱床下塌，叉峰。柱不线时，要加快流速也需以每次 0. 5ml / mi n的速率递增上去（或下来），勿急升（降），以免泵损坏。

　　⑤测定完毕请用水冲柱 1小时，甲醇 30分钟。如果第二天仍使用，可用水以低流速（0. 1~0. 3ml / mi n）冲洗过夜（注意水要够量），不须冲洗甲醇。另外需要特别注意的是：对于含碳量高、封尾充分的柱，应先用含 5~10%甲醇的水冲洗，再用甲醇冲洗。

　　乙腈的特性：低波长吸收小，极性较甲醇大有一定的粘黏度（易使单向阀粘黏），对PEEK及Tefl管有侵蚀性。

　　使用二氯乙酸、丙酮、四氢呋喃、二氯甲烷、氯仿溶剂时，对PEEK管和头有侵蚀作用，因此请勿将两者在一起使用。

　　送液泵：进液管是否有气泡，压力显示？是否波动太大（0.3-0.5 MPa之内)，有无漏液。

　　保留在柱子和系统中的液体（甲醇或异丙醇），水能够发霉及长菌，乙腈长期保存对吸液管和PEEK头有危害。